掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验发现掺锶的聚磷酸钙材料对单独培养内皮细胞或成骨细胞的行为有显著促进作用。
目的：观察掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响。
方法：取第3代人脐静脉内皮细胞与人成骨肉瘤细胞MG63以2∶1的浓度比接种于24孔板中，然后再分别加入掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙与羟基磷灰石，共培养7 d后。采用ELISA法检测细胞血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达，采用MTT法检测细胞活性。
结果与结论：与聚磷酸钙与羟基磷灰石相比，在掺锶聚磷酸钙表面生长的细胞呈现更加良好的形态，细胞融合生长形成单层覆盖在材料表面，并且在材料表面有一定的跨度生长，说明掺锶聚磷酸钙材料能促进内皮细胞在其上黏附、伸展，有利于细胞的生长和增殖。掺锶聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组(P < 0.05)，说明掺锶聚磷酸钙可上调血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 掺锶聚磷酸钙, 内皮细胞与成骨细胞共培养体系, 血管内皮生长因子, 碱性成纤维细胞生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Our previous studies have shown that strontium-doped calcium polyphosphate containing low-dose strontium appears to have a significant effect on angiogenesis-related behaviors of monocultured umbilical vein endothelial cells and osteoblasts.
OBJECTIVE: To investigate the effect of strontium-doped calcium polyphosphate on angiogenesis-related behaviors of umbilical vein endothelial cells and osteoblasts co-cultured, including cell adhesion, spreading, proliferation, as well as the protein secretion of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor from co-culture system in vitro.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells and osteoblastic cells (MG63) were utilized in this study. Cells from passage 3 were used for preparation of the cell-scaffold constructs. After placed in 24-well plate at a ratio of 2:1, human umbilical vein endothelial cells and MG63 cells were seeded onto strontium-doped calcium polyphosphate, calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds and co-cultured for 7 days. The vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor protein levels were determined through a double ligand enzyme-linked immunosorbent assay. The colorimetric 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide assay was performed to quantify the effect of scaffolds on cell proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with those on calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds, cells on strontium-doped calcium polyphosphate scaffolds attached and spread better with a significantly improved cell proliferation. More importantly, the vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor expressions were significantly higher in the strontium-doped calcium polyphosphate group than the other two groups (P < 0.05), indicating strontium-doped calcium polyphosphate can up-regulate levels of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor proteins.

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Key words: biocompatible materials, calcium phosphates, strontium, endothelial cells, osteoblasts

中图分类号:

R318

彭红，顾志鹏，黄程程，徐源廷，余喜讯. 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(3): 365-370.

Peng Hong, Gu Zhi-peng, Huang Cheng-cheng, Xu Yuan-ting, Yu Xi-xun. Effects of strontium-doped calcium polyphosphate on behavior and angiogenic growth factors expression of co-cultured osteoblasts and endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(3): 365-370.

图/表（结果） 3

2.1 支架材料的多孔结构和表面形貌观察 图1为掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料表面形貌的扫描电镜图片。

从低倍图片可以看出，这几种材料呈三维贯通的多孔结构，主要为圆形孔，孔互相之间有联通，且分布均匀，这就为细胞的长入提供了前提条件；支架材料的孔隙度约为65%，孔径大小在100-400 µm范围；与聚磷酸钙和羟基磷灰石相比较，掺锶聚磷酸钙的表面更光滑，晶粒堆积更紧密；从5 000倍的图片看，掺锶聚磷酸钙的晶粒更大且圆滑，晶粒间有较清晰的界限，通过非晶相紧密地连接在一起形成更紧密的表面和体积堆积。掺锶聚磷酸钙中的非晶相可能为聚磷酸锶，由于聚磷酸锶熔点比聚磷酸钙低，而烧结温度介于聚磷酸锶和聚磷酸钙的熔点之间，在此温度下，聚磷酸锶熔融将聚磷酸钙晶粒间缝隙填补，从而形成更紧凑的结构。

2.2 共培养细胞在材料表面生长的扫描电镜观察 对于掺锶聚磷酸钙支架材料是否能够维持细胞良好形态的研究是必要的。图2显示了细胞与支架材料复合培养7 d后，细胞在掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石表面的伸展和黏附。

与聚磷酸钙和羟基磷灰石相比，在掺锶聚磷酸钙表面生长的成骨肉瘤细胞和内皮细胞呈现出更加良好的细胞形态，成骨细胞呈典型的纺锤形，内皮细胞呈不规则的菱形，细胞边缘清晰完整，尺寸正常，细胞伪足清晰可见，细胞融合生长形成单层覆盖在材料表面，并且在材料表面有一定的跨度生长(图2F)。

通过图片可以看到，在细胞培养液中浸泡过的3种支架材料呈现不同的表面形态，掺锶聚磷酸钙的表面比聚磷酸钙和羟基磷灰石更加平滑，这说明掺锶聚磷酸钙能促进内皮细胞在其上黏附、伸展，进而有利于细胞的生长和增殖。可能是由于在细胞培养液中的掺锶聚磷酸钙能维持良好的材料表面，同时降解释放出锶的元素有利于细胞的生长，使细胞更好地黏附和生长。

2.3 共培养的细胞与支架材料复合培养的生长曲线 图3A为共培养的成骨肉瘤细胞和内皮细胞与3种支架材料复合培养不同时间的细胞增殖情况。随着培养时间的延长，各组细胞增殖都呈上升趋势，峰值出现在第10天，到第14天，由于培养液中细胞分泌物的过多累积，细胞活性整体回落。在14 d的复合培养时间段内，掺锶聚磷酸钙组的细胞数量一直明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组，细胞增殖速率也一直明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组。

另外，聚磷酸钙组细胞增殖速率也一直明显高于羟基磷灰石组。相比于聚磷酸钙和羟基磷灰石，在掺锶聚磷酸钙表面共培养细胞可更好地黏附和生长，可能是因为培养液中同时有释放出的锶元素能进一步刺激促进细胞的生长行为，使得掺锶聚磷酸钙能显著促进细胞的增殖。

2.4 不同支架材料上细胞血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的蛋白分泌量 图3B显示了共培养的成骨细胞和内皮细胞与不同支架材料复合培养7 d后，细胞培养上清液中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子蛋白分泌量的检测情况。

由图可见，掺锶聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组(P < 0.05)。另外，聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子也要高于羟基磷灰石组(P < 0.05)。ELISA实验结果表明掺锶聚磷酸钙明显上调了血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的蛋白表达，原因可能是掺锶聚磷酸钙降解释放出锶元素，同时材料优良的三维结构和表面形貌为细胞生长提供了良好的微环境，有利于细胞功能的表达。

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引言

骨组织工程的目标是用来修复大面积骨骼缺损。骨修复过程不仅是新骨的生长，还需要血循环重建，这样才能为新生骨组织中的细胞提供养分，排泄废物^[1-2] ，所以理想的骨组织工程支架材料应该具有促血管化功能。在早期骨折愈合过程中会出现缺损局部高能代谢状态，此时对血供及能量物质的需求提高^[3-5] ，因此在构建组织工程化骨组织的同时，促进小血管的长入及细胞与材料复合物内血供的重建就成为骨组织工程由基础向临床应用的关键性环节^[6] 。血管生成主要受到血管化生长因子的影响。在所有己知的血管化生成因子成员中，血管内皮生长因子是促血管生成作用最为特异而确切的因子，其在生理和病理性血管生成中都起着核心的调节作用^[7] 。碱性成纤维细胞生长因子在促血管生成过程中具有多效性特点，它是一种内源性多肽生长因子，同时是另一种最有效的促进血管生成因子，它通过提高成骨细胞的增殖和促进内皮细胞的生长来促进骨形成和血管化^[8] 。成骨细胞和内皮细胞在生长良好的状态下都可以表达血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。
然而，在新骨生长过程中诱导快速血管化的困难性成为骨组织工程应用于坏损组织更换的主要限制因素^[9-10] 。Pacicca等^[11]研究发现成骨细胞与内皮细胞共培养，成骨细胞分泌的血管内皮生长因子量显著高于单一细胞组，同时有血管样结构形成。Hofmann等^[12-13]发现成骨细胞与内皮细胞共培养于支架材料上能够生成血管样结构。共培养的成骨和内皮细胞之间通过复杂的相互作用控制着骨形成和血管化^[14] ，将两种细胞在支架材料上共培养是解决骨组织工程促血管化的一种有效途径。另一方面，支架材料在骨组织工程的血管化方面也起着重要作用。如果生物材料或组织工程支架材料自身具有诱导血管生成的生物活性，就可以刺激移植或迁移到支架材料上的细胞释放血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，然后与成骨细胞和内皮细胞的共培养体系相结合，将会增加在新骨生长过程中诱导快速血管化的可能性。
锶是一种具有促进骨形成和减少骨吸收双重作用的骨组成元素^[15-17] ，同时锶元素能有效提高材料的生物相容性和生物活性。聚磷酸钙是一种具有优良机械性能和生物相容性的生物陶瓷骨组织工程材料，在骨修复方面受到广泛关注^[18-19] 。
前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用^[20-21] 。实验在3种不同支架材料掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石上将成骨细胞与内皮细胞以一定比例共培养，研究掺锶聚磷酸钙支架材料对共培养体系的细胞行为和血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子表达的影响及机制。

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材料方法

设计：体外细胞学观察实验。

时间及地点：于2011年7月至2012年7月在四川大学完成。

材料：

细胞株：人脐静脉内皮细胞株HUVEC，由四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室提供；人成骨肉瘤MG63细胞株，由四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室提供。

实验方法：

支架材料的制备：按锶/钙一定摩尔比例称取碳酸锶、碳酸钙，与磷酸溶液反应制备磷酸二氢盐，无水乙醇除去多余磷酸。置混合盐于坩埚内，500 ℃煅烧，升温使熔融，再淬火得到无定型烧料。研磨筛分烧料，取粉末与一定量的致孔剂和黏合剂混合，压制成直径10 mm，高2 mm的型胚，一定温度下烧结制得聚磷酸钙和含锶量为8%的掺锶聚磷酸钙多孔支架，γ射线辐照灭菌后备用。

内皮细胞和成骨样细胞的培养：将冻存的内皮细胞HUVECs和人成骨肉瘤MG63细胞复苏，用含体积分数为10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI1640培养液于37 ℃、体积分数为5%CO₂的饱和湿度下培养，隔天换液。取第3代细胞备用。

细胞与支架材料的复合培养：在接种细胞前，将γ射线辐照灭菌后的掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料在RPMI-1640培养液中浸泡12 h，其中羟基磷灰石和聚磷酸钙作为实验对照。将第3代两种细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液。将两种种子细胞与8%掺锶聚磷酸钙(聚磷酸钙或羟基磷灰石)复合培养于24孔板中，每孔细胞数相同。人成骨肉瘤MG63细胞接种浓度为0.3×10⁸ L^-1，200 µL/孔；人脐静脉内皮细胞HUVEC接种浓度为0.3×10⁸L^-1， 100 µL/孔，即人成骨肉瘤MG63和人脐静脉内皮细胞HUVEC直接共培养比例为2∶1。选用2∶1的比例是因为成骨细胞与内皮细胞以2∶1共培养时两种细胞有更好的相容性，碱性磷酸酶等有更好的活性^[22-23]。

共培养体系细胞形态的扫描电镜观察：细胞在掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料上培养7 d后，取出材料，PBS洗涤后，3%戊二醛固定，4 ℃过夜，经体积分数为30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%的乙醇梯度脱水(每个体积分数乙醇脱水2次，15 min/次)，乙酸异戊酯置换，CO₂临界点干燥，表面喷金后作扫描电镜观察，实验步骤由四川大学分析测试中心扫描电镜室协助完成。

细胞增殖实验：将细胞支架复合物培养14 d，分别在1，3，7，10，14 d行MTT法检测细胞活性，即加入MTT溶液60 μL/孔，继续培养4 h，小心吸弃上清，加入二甲基亚砜 150 μL/孔。振荡10 min，在酶标仪上492 nm波长下测定各孔吸光度值，得出各组细胞的增殖情况，并绘制生长曲线。

ELISA检测支架材料上细胞血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的分泌：细胞分别与掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支架材料复合培养7 d，至细胞汇合后，离心取上清液，按照R&D公司的ELISA试剂盒说明进行血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的测定。

主要观察指标： ①两种细胞与不同支架共培养后的细胞形态。②两种细胞与不同支架共培养后的增殖及细胞因子的分泌。

统计学分析：由第一作者采用SPSS13.0进行统计学处理，数据用x(_)±s表示，运用单因素方差分析进行检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

两种细胞与支架材料复合培养的增殖实验说明锶能有效促进共培养体系细胞的增殖。同时结合扫描电镜观察细胞在材料上的生长形态，发现掺锶聚磷酸钙具有良好的材料表面、细胞界面，有利于细胞的黏附和铺展，进而促进细胞的增殖。
ELISA实验结果表明掺锶聚磷酸钙明显上调了血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的蛋白表达，与增殖实验结果一致。材料的血管化需要生长因子的参与。血管内皮生长因子通过诱导内皮细胞增生，促进血管的形成，同时还通过促血管形成参与骨的发育；作为旁分泌因子参与骨形成与代谢^[24-25] 。碱性成纤维细胞生长因子可以自分泌和旁分泌两种方式促进自身细胞与周围细胞的增殖、分化、蛋白质合成等生物学行为。实验结果表明，掺锶聚磷酸钙可作为一种潜在的具有促血管化作用的材料使用，这为在骨组织工程上解决血管化问题提供了一种新思路。
掺锶聚磷酸钙中释放出的锶能更好地促进细胞在支架材料上的黏附和增殖，进而促进血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的表达。有研究表明，锶是通过激活细胞钙敏感受体，从而激活三磷酸肌醇和促有丝分裂原活化蛋白激酶来实现促进细胞增殖的^[26] 。Tokuda等^[27]报道碱性成纤维细胞生长因子可以激活成骨细胞内的信号因子p44/p42有丝分裂原活化蛋白激酶来促进成骨细胞血管内皮生长因子的表达，说明锶元素很可能是通过细胞钙敏感受体作用于MAPK来调节血管内皮生长因子表达的。血管内皮生长因子表达受很多细胞因子的影响，如成骨细胞分泌的转化生长因子β能刺激血管内皮生长因子的表达、内皮细胞分泌的成纤维细胞生长因等都能刺激血管内皮生长因子的表达^[28] 。有研究表明锶能通过钙通道进入细胞内^[29] ，可能通过调节上述因子进而促进血管内皮生长因子的表达。Jaebong等^[30]研究发现当成骨细胞受外界刺激后，能迅速表达c-fos基因，然后激活转录蛋白FOS。FOS是在细胞核内起作用的蛋白质，它与其他一些转录因子结合形成活性蛋白1，活性蛋白1再与基因序列中的TRE位点结合，启动这些基因的转录导致一系列生物学效应的产生。碱性成纤维细胞生长因子基因的启动子区就有TRE位点，故活性蛋白1可与之特异性结合，从而启动碱性成纤维细胞生长因子基因的转录，进而产生一系列生物学效应，因此可认为FOS作用于TRE位点是其诱导碱性成纤维细胞生长因子表达的途径之一^[31] 。而细胞微环境中的锶可能是诱导c-fos基因表达的外界刺激因素，诱导细胞碱性成纤维细胞生长因子表达。综上，掺锶聚磷酸钙在降解过程中释放的锶可以通过一系列的生物效应促进细胞血管化生长因子的表达。

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延伸阅读

掺锶聚磷酸钙中释放出的锶能更好地促进细胞在支架材料上的黏附和增殖，进而促进血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的表达。有研究表明，锶是通过激活细胞钙敏感受体，从而激活三磷酸肌醇和促有丝分裂原活化蛋白激酶来实现促进细胞增殖的。Tokuda等报道碱性成纤维细胞生长因子可以激活成骨细胞内的信号因子p44/p42有丝分裂原活化蛋白激酶来促进成骨细胞血管内皮生长因子的表达，说明锶元素很可能是通过细胞钙敏感受体作用于MAPK来调节血管内皮生长因子表达的。血管内皮生长因子表达受很多细胞因子的影响，如成骨细胞分泌的转化生长因子β能刺激血管内皮生长因子的表达、内皮细胞分泌的成纤维细胞生长因等都能刺激血管内皮生长因子的表达。有研究表明锶能通过钙通道进入细胞内，可能通过调节上述因子进而促进血管内皮生长因子的表达。Jaebong等研究发现当成骨细胞受外界刺激后，能迅速表达c-fos基因，然后激活转录蛋白FOS。FOS是在细胞核内起作用的蛋白质，它与其他一些转录因子结合形成活性蛋白1，活性蛋白1再与基因序列中的TRE位点结合，启动这些基因的转录导致一系列生物学效应的产生。碱性成纤维细胞生长因子基因的启动子区就有TRE位点，故活性蛋白1可与之特异性结合，从而启动碱性成纤维细胞生长因子基因的转录，进而产生一系列生物学效应，因此可认为FOS作用于TRE位点是其诱导碱性成纤维细胞生长因子表达的途径之一。而细胞微环境中的锶可能是诱导c-fos基因表达的外界刺激因素，诱导细胞碱性成纤维细胞生长因子表达。综上，掺锶聚磷酸钙在降解过程中释放的锶可以通过一系列的生物效应促进细胞血管化生长因子的表达。

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